Szerkesztő:Scytharys/próbalap
Munka folyamatban. Célom, hogy ezt a cikket átdolgozzam modernebbre és átláthatóbbra. Nagyrészt valószínűleg az angol cikk fordítása lesz.
DNS-szekvenálás
[szerkesztés].svg)
A DNS-szekvenálás a DNS nukleotidsorrendjének meghatározása. Ide értendő minden olyan módszer vagy technológia, amely a DNS bázisok - adenin, guanin, citozin és timin - sorrendjének meghatározására alkalmas.
A nukleotidszekvenciák megállapítása és vizsgálata elengedhetetlen az élet működésének megfejtéséhez, manapság a nukleinsavak szekvenálása számos biológiai és orvosi kutatás nélkülözhetetlen eszközét képezi.[1]
Módszerek
[szerkesztés]Korai módszerek
[szerkesztés]Az első DNS-szekvenálási módszereket az 1970-es években dolgozták ki. Ezek közul a Frederick Sanger által kidolgozott láncterminációs szekvenálás hozta az első nagy áttörést.[2]
A Sanger-féle láncterminációs szekvenálásnak az alapját az képezi, hogy egy vizsgálandó DNS-mintát úgy másolnak le sok példányban DNS-polimeráz enzimmel, hogy a reakcióelegyhez egy módosított (radioaktívan- vagy fluoreszcensen jelölt) nukleotidot adnak hozzá, aminek beépulésekor az adott lánc szintézise leáll.
A módszer során négy párhuzamos reakciót hajtanak végre. Mindegyik reakcióelegy tartalmazza mind a négy dezoxinukleotid-trifoszfátot (dNTP), de legfeljebb csak egyféle didezoxinukleotid-trifoszfátot (ddNTP). Tehát mindegyik tartalmaz dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t, de például a ddNTP-k közul az egyik csak ddATP-t tartalmaz. A ddNTP-k cukorrészében a 3' szénatomhoz nem -OH csoport, hanem csak egy H atom kötődik. Így ha a DNS polimeráz (véletlenszerűen) egy ddNTP épít be a láncba, akkor termináció következik be, mivel nincs hova kötődnie a következő nukleotidnak (az "új" nukleotid 5′ foszfát-csoportja a "régi" nukleotid 3' -OH csoportjához tudna kötődni).
Ezt követően a kulonböző hosszúságú DNS-fragmenseket gélelektroforézissel elválasztják, tehát méret alapján rendezik. Az új DNS-láncok méreteinek ismeretében pedig a templát DNS-szál bázissorrendjét le lehet olvasni egy úgynevezett szekvenáló létra alapján.
Nagy áteresztőképességű módszerek (NGS)
[szerkesztés]A 2000-es évektől kezdve modernebb szekvenálási módszerek jelentek meg[3], amelyeket "Új generációs szekvenálásnak" neveznek. NGS technológiákkal a teljes emberi genom ma már egyetlen nap alatt szekvenálható. Ez a korábbi Sanger-szekvenálási technológiával, amelyet az emberi genom megfejtésére is használtak, több mint egy évtizedet vett igénybe.[4]
A restrikciós enzimek egy lehetséges alkalmazása az ún. restrikciós térképek készítése, ami (főleg régebben) arra jó, hogy DNS-ek „ujjlenyomatait” készítsük el, vagy kissé különböző DNS-szálakat hasonlíthassunk össze. A módszer a következő: a DNS preparátumot összekeverjük egy ilyen enzimmel. Ez hasít bizonyos helyeken, a hosszú szálakból rövidebbek lesznek. Ezután másik enzimet keverünk hozzá, ami más helyeken fog hasítani. Az eljárást lehet még folytatni több enzimmel is. Végül a keletkezett fragmenteket gélelektroforézis útján szétválogatjuk méret szerint. A kapott mintázat jellemző lesz az adott génre vagy DNS-szakaszra. A módszer a gél típusától függően 100-20 000 bázispár hosszú fragmentek szétválogatását teszi lehetővé.
Ha azt akarjuk megvizsgálni, hogy egy bizonyos szekvencia előfordul-e egy DNS-molekulában, akkor a fenti módszer után még denaturálni kell a fragmenteket, hogy egyszálú láncokat kapjunk, majd a keresett szekvencia komplementerével összekeverni. Ez a lánc azzal a lánccal fog hibridizálni, amelyik a párja, és ha izotóppal volt jelölve (pl. 32-es foszforral), akkor meg lehet találni, hogy az ilyen szekvenciájú fragmentek a gélnek mely pontján gyűlnek össze (Southern Blotting). Ha az összes vonal szekvenciáját sikerül meghatározni, akkor a restrikciós enzimek ismeretében meg lehet határozni az eredeti molekula szekvenciáját.
A szekvenálásra egy másik lehetőség, hogy keressünk olyan kémiai reakciókat, amelyek a DNS-láncokat csak az egyik fajta nukleotidnál hasítják. Ha pontosan ugyanolyan láncaink vannak (ez restrikciós endonukleázokkal elérhető), és úgy állítjuk be a körülményeket, hogy minden lánc csak egyszer hasadjon, és a láncok egyik vége jelölve van, akkor meg lehet csinálni a következőt: a DNS preparátumot négy részre osztjuk, és mindegyiken elvégezzük a különböző nukleotidspecifikus reakciókat. Kedvező esetben így mindenfajta hosszúságú fragment létrejön. Ezután elektroforézissel szétválogatjuk őket, a csíkok helyéből egyszerűen leolvasható, hogy melyik helyen milyen bázis volt.
Az adatok értelmezése
[szerkesztés]Etikai kérdések
[szerkesztés]Jegyzetek
[szerkesztés]Nyitray László és Pál Gábor: A biokémia és molekuláris biológia alapjai (2013) (19.5 DNS-szekvenálás fejezet)
További információk
[szerkesztés]- Dr. Gál Anikó: Genetikai vizsgálatok módszerei. [2015. január 6-i dátummal az eredetiből archiválva]. (Hozzáférés: 2021. március 17.)
- BékésiAngéla: Újgenerációsszekvenálás Újgenerációsszekvenálás(NextGenerationSequencing)Technikák Alkalmazási területek Bioinformatika,BME ABÉT, 2019 tavaszi félév. (Hozzáférés: 2021. március 17.)
- Egyéb forrásoknak: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3841808/ és https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4727787/
- https://www.tandfonline.com/doi/full/10.2144/btn-2019-0011
Referenciák
[szerkesztés]- ↑ Heather, James M. (2016. január 1.). „The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA”. Genomics 107 (1), 1–8. o. DOI:10.1016/j.ygeno.2015.11.003. ISSN 0888-7543. PMID 26554401.
- ↑ Heather, James M. (2016. január 1.). „The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA”. Genomics 107 (1), 1–8. o. DOI:10.1016/j.ygeno.2015.11.003. ISSN 0888-7543. PMID 26554401.
- ↑ Genomics, Front Line: A brief history of Next Generation Sequencing (NGS) (angol nyelven). Front Line Genomics, 2021. július 26. (Hozzáférés: 2024. augusztus 3.)
- ↑ Behjati, Sam (2013. december 1.). „What is next generation sequencing?”. Archives of Disease in Childhood. Education and Practice Edition 98 (6), 236–238. o. DOI:10.1136/archdischild-2013-304340. ISSN 1743-0585. PMID 23986538.