HPLC

A HPLC, avagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (angolul High Performance Liquid Chromatography, vagy High Pressure Liquid Chromatography) a biokémiában és analitikai kémiában vegyületek elválasztására, azonosítására és mennyiségi meghatározására gyakran használt kromatográfiás eljárás.

A HPLC rendszer a következő alkotórészekből áll: a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazó oszlopból (kolonnából), a mobil fázist (mozgó fázist, eluenst) az oszlopon átnyomó pumpából valamint a molekulák retenciós (visszatartási) idejét jelző detektorból. A retenciós idő az álló fázis, a vizsgált molekula és a mozgó fázis közötti kölcsönhatásoktól függ.

A HPLC készülék - Balról jobbra: két különböző oldószer gradiensét előállító pumpa, töltött acélkolonna, végül az abszorbanciát mérő detektor

A mérés kivitelezése

A vizsgálandó mintát feloldjuk és az oldat kis térfogatát az áramló mozgó fázisba vezetjük (injektáljuk). A minta, miközben keresztülhalad a kolonnán, az álló fázissal való specifikus kémiai vagy fizikai kölcsönhatások révén visszamarad a folyadékáramhoz képest (retardálódik). A visszatartás mértéke a vizsgálandó anyag és az állófázis tulajdonságaitól valamint a mozgó fázis összetételétől függ. Azt az időtartamot, mely alatt egy adott anyag eluálódik (megjelenik a kolonna végén) retenciós időnek nevezzük. Egy adott rendszerben a retenciós idő az egyes vizsgált vegyületek viszonylag egyedi jellemzője. Nagyobb nyomást alkalmazva megnövelhető a lineáris áramlási sebesség, így a komponenseknek kevesebb idejük marad a kolonnán belüli diffúzióra, ami javítja az egyes anyagok közötti elválást. Mozgó fázisként általában vizet és különböző szerves folyadékokat, leggyakrabban metanolt ill. acetonitrilt használnak. A minta komponenseinek jobb elválasztását segíthetik a vízhez adott pufferek vagy sók, vagy egyéb anyagok, mint például az ionpár képzőként alkalmazott trifluorecetsav.

További lehetőséget jelent a HPLC technikánál a mozgó fázis összetételének mérés közbeni változtatása, amit gradiens elúciónak nevezünk. Például fordított fázisú kromatográfiában a vizsgált anyagok hidrofobicitásának függvényében a mérést kezdhetjük 5% metanolt tartalmazó mozgó fázissal, majd 25 perc alatt a metanol arányát lineárisan 50%-ra növeljük. Gradiens elúciónál a vizsgálandó keverék komponenseinek elválása függ a komponensnek az aktuális mozgó fázis összetételhez valamint az álló fázishoz való affinitásától. Ez a megoszlási folyamat hasonló a folyadék-folyadék extrakciót jellemző megoszláshoz, azzal az eltéréssel, hogy nem lépcsőzetes, hanem folyamatos. A fenti példában, ahol víz/metanol gradienst használtunk, az erősebb hidrofób tulajdonságot mutató komponensek viszonylag magasabb metanol tartalomnál eluálódnak (a metanol a hidrofóbabb komponens), míg a hidrofil komponensek alacsony metanol/magas víz aránynál eluálódnak. Az oldószerek, adalékanyagok és a gradiens megválasztása az állófázis és a vizsgálandó anyag tulajdonságaitól függ.

A HPLC típusai

Normál fázisú kromatográfia

A normál fázisú HPLC (NP-HPLC) polaritás alapján választja el a vizsgált minta komponenseit, ez volt az elsőként alkalmazott HPLC-s eljárás. Az NP-HPLC poláris álló fázist és apoláris mozgó fázist alkalmaz, viszonylag poláris anyagok elválasztására alkalmazható hatékonyan. A vizsgálni kívánt poláris anyag kapcsolatba lép a poláris álló fázissal s így visszamarad. Az adszorpció erőssége nő a vizsgált anyag polaritásának növekedésével. A poláris komponens és a (mozgó fázishoz képest) poláris álló fázis kölcsönhatásának erősödésével nő a retenciós idő. A kölcsönhatás erőssége nemcsak a vizsgált molekula funkciós csoportjaitól függ, hanem sztérikus tényezőktől is, ezért ezzel a módszerrel szerkezeti izomerek elválasztása is lehetséges.

Ha a mozgó fázisban polárisabb oldószereket használunk, csökken a vizsgálandó anyagok retenciós ideje, míg hidrofób oldószerek inkább növelik a retenciós időt. Nagyon poláris oldószerek megkötődhetnek az állófázis felszínén, így használatuk deaktiválhatja a kolonnát.

Az NP-HPLC jelentősége az 1970-es években jelentős mértékben lecsökkent a fordított fázisú HPLC fejlődésével párhuzamosan. NP-HPLC esetén jóval kevésbé stabil a retenciós idő, mivel víz vagy más protikus szerves oldószerek megváltoztatják a szilika vagy alumínium-oxid kromatográfiás állófázis hidratáltsági állapotát. Újabban a HILIC állófázisok kifejlesztésével javult a retenciós idő reprodukálhatósága.

Fordított fázisú kromatográfia

A fordított fázisú HPLC (Reversed phase HPLC, RP-HPLC vagy RPC) esetén az állófázis felülete apoláris, míg a mozgó fázis poláris, jellemzően víz és valamely szerves oldószer elegye. Gyakran használt álló fázis az RMe₂SiCl-dal kezelt szilika, ahol R valamilyen egyenes szénláncú alkilcsoport, pl. C₁₈H₃₇ vagy C₈H₁₇. Ilyen álló fázisokat alkalmazva az apolárosabb molekulák retenciós ideje hosszabb, míg a poláros molekulák gyorsabban eluálódnak. Apoláros oldószert adva a mozgó fázishoz csökkenthetjük, míg hidrofilebb oldószer hozzáadásával pedig növelhetjük a retenciós időt. Az RP-HPLC használata annyira elterjedt, hogy gyakran tévesen HPLC-ként emlegetik, minden további pontosítás nélkül. A gyógyszeripar rendszeresen alkalmazza az RP-HPLC-t a gyógyszerek minőség-ellenőrzése során.

Az RP-HPLC a hidrofób kölcsönhatások elvén működik, mely a poláris mozgó fázis, a viszonylag apoláris vizsgálandó anyag és az apoláris állófázis között működő repulzív erők eredménye. A vizsgálandó anyag kötődése az állófázishoz arányos a vizsgált molekula apoláris szegmense körül a vizes mozgó fázisban a ligandummal való kölcsönhatásban kialakuló érintkező felület területével. A retenció csökkenthető, ha kevésbé poláros oldószert (metanolt, acetonitrilt) adva a mozgó fázishoz csökkentjük a víz felületi feszültségét.

A vizsgált molekula szerkezeti tulajdonságai fontos szerepet töltenek be a retenciós tulajdonságok meghatározásában. Általánosságban elmondhatjuk, hogy a nagyobb, a vízzel kapcsolatba nem lépő, hidrofób felülettel rendelkező vizsgálandó anyagok (C-H, C-C, ill. általában az apoláros kötések, mint pl. az S-S) retenciós ideje hosszabb. Másrészt a poláros csoportok, mint például az -OH, -NH₂, COO^- vagy -NH+3 visszatartása kisebb, mivel ezek jól elegyednek vízzel. Ugyanakkor a nagyon nagy molekulák esetén a ligandumok alkil láncai és a vizsgált anyag nagy felülete közötti kapcsolat hiányos lehet, valamint a molekulának gondot jelenthet az állófázis pórusaiba való belépés.

A hidrofób (apoláris) felülettel arányosan nő a retenciós idő. Az elágazó szénláncú vegyületek gyorsabban eluálódnak, mint egyenes láncú izomerjük, mivel kisebb a felületük. Hasonlóan az egyszeres C-C kötésű vegyületek később eluálódnak, mint a kettős vagy hármas kötésűek, mivel a kettős vagy hármas kötés rövidebb, mint az egyszeres. A mobil fázis felületi feszültsége (az eluens struktúrájának fő rendező ereje) mellett, más mobil fázist módosító anyagok is befolyásolják a vizsgált komponensek retencióját. Például szervetlen sók hozzáadása lineáris összefüggés szerint mérsékelten növeli a vizes oldatok felületi feszültségét (kb. 1,5·10⁻⁷ J/cm² per mol NaCl esetén, 2,5·10⁻ J/cm² per mol (NH₄)₂SO₄ esetén), és mivel a vizsgált molekula és az oldószer közötti kapcsolat entrópiáját a felületi feszültség szabályozza, sók hozzáadása növelheti a retenciós időt. Ezt az eljárást alkalmazzák pl. fehérjék gyenge elválasztására, regenerálására és biológiai aktivitásának megőrzésére fehérje analízis során (hidrofób kölcsönhatás kromatográfia - hydrophobic interaction chromatography, HIC).

További fontos tényező az elválasztás szempontjából a pH hatása, mivel megváltoztathatja a vizsgált anyag hidrofobicitását. Ezért a legtöbb módszer valamilyen puffert alkalmaz, például nátrium-foszfátot, a pH szabályozására. A pufferek több szerepet is betöltenek: szabályozzák a pH-t, semlegesítik az álló fázis felszínén esetleg hozzáférhető maradék szilikát töltését valamint ionpár képző reagensként semlegesítik a vizsgált anyag töltését. Az ammónium-formiátot gyakran használják tömegspektrometriás detektálás esetén a bizonyos vizsgált molekulák detektálhatóságának növelésére ammónium komplex képződése miatt. Tömegspektrometriás vizsgálatoknál az eluenshez gyakran adnak illékony szerves savakat, például ecetsavat vagy még gyakrabban hangyasavat. Tömegspektrometriás vizsgálatoknál ritkán alkalmaznak trifluor-ecetsavat, mivel felhalmozódik a detektorban és az oldószer szállító rendszerben, de másféle detektálással dolgozó alkalmazásoknál hasznos lehet karbonsav vegyületek retenciójának növelésében, mivel ez az egyik legerősebb szerves sav. A savak és pufferek hatása az alkalmazástól függ, de általában javítják a kromatográfiás meghatározás minőségét.

A fordított fázisú kolonnák sokkal kevésbé sérülékenyek, mint a normál fázisú szilika oszlopok, bár számos fordított fázisú kolonna alkil-derivatizált szilika szemcséket tartalmaz, melyeket soha nem szabad vízben oldott bázisokkal használni, mivel ezek lebontják a szilika szemcséket. Vízben oldott savakat használhatunk, de lehetőleg ne tegyük ki a kolonnát túl sokáig savaknak, mivel ezek korrodálhatják a HPLC készülék fém alkatrészeit. Használat után az RP-HPLC kolonnákon tiszta oldószert kell áramoltatni, hogy eltávolítsuk a maradék savakat vagy puffereket, majd a megfelelő oldószer alatt kell őket tárolni.

Használat után a fordított fázisú kolonnákon tiszta oldószert kell átáramoltatni a savak vagy sók maradékának eltávolítására, majd megfelelő oldószerelegyben kell tárolni. Ha meg akarjuk őrizni a kolonna elválasztó képességét az oszlop fémtartalmát a lehető legalacsonyabban kell tartani. A kolonna fémtartalmának ellenőrzésére alkalmas a következő módszer: injektáljunk 2,2'- és 4,4'- bipiridin elegyét tartalmazó mintát az oszlopra. Mivel a 2,2'-bipiridin kelátot képezhet fémionokkal, ezért a 2,2'-bipiridin csúcsa torzul, ha fém ionok vannak jelen a szilika felszínén.

Méretkizárásos (size exclusion) kromatográfia

A méretkizárásos kromatográfia (angolul: size exclusion chromatography, rövidítve: SEC), melyet gél permeációs kromatográfiaként vagy gélszűréses kromatográfiaként is említenek, méret alapján választja el a részecskéket. Általában csak kis felbontás érhető el vele, ezért általában csak a tisztítás utolsó lépéseként használják. Hasznos még tisztított fehérjék harmadlagos vagy negyedleges szerkezetének meghatározásában. Az eljárást széleskörűen alkalmazzák poliszacharidok molekulatömegének meghatározására. A méretkizárásos kromatográfia az Európai Gyógyszerkönyv által is előírt hivatalos módszer a kereskedelmi forgalomban beszerezhető különböző alacsony móltömegű heparinok molekulatömegének összehasonlítására.

Ioncserés kromatográfia

Ioncserés kromatográfia esetén a retenció az oldott ionok és az álló fázishoz kötött töltéssel rendelkező helyek között létrejövő kölcsönhatáson alapszik. Az ugyanolyan töltésű ionok nem kötődnek az oszlopon. Az alábbi ioncserélő típusok ismeretesek:

• Polisztirol gyanták - ezek alkalmasak keresztkötések kialakítására, mellyel növelhető a lánc stabilitása. A keresztkötöttséget növelve nő az ekvilibrálási idő és egyértelműen javul a szelektivitás.
• Cellulóz és dextrán ioncserélők (gélek) - ezeket nagyobb lyukméretük és alacsonyabb töltéssűrűségük teszi alkalmassá fehérjék elválasztására.
• Kontrollált lyukméretű üveg vagy porózus szilika

Az ioncserélők általában a nagyobb töltésű és kisebb átmérőjű ionokat kötik jobban. Az ellenion (a gyanta funkciós csoportjaira vonatkoztatott) koncentráció növelése csökkenti a retenciós időt. Kationcsere esetén a pH növelése csökkenti a retenciós időt, míg anioncsere esetén a pH csökkentésével érhető el a retenciós idő csökkenése.

Az ioncserés kromatográfiát a következő területeken alkalmazzák széleskörűen: víztisztítás, nyomokban jelenlevő komponensek elődúsítása, ligandumcsere-kromatográfia, fehérjék ioncserés kromatográfiája, szénhidrátok és oligoszacharidok magas pH-n végzett anioncserés kromatográfiája stb.

Bioaffinitás kromatográfia

A kromatográfia e fajtája biológiailag aktív anyagok azon tulajdonságán alapul, hogy képesek stabil, specifikus és reverzibilis komplexek létrehozására. A komplexek létrehozásában az ismert intermolekuláris kölcsönhatások vesznek részt, mint például a Van der Waals-kölcsönhatások, elektrosztatikus kölcsönhatás, hidrofób kölcsönhatás és hidrogénkötés.

Izokratikus áramlás és gradiens elúció

Amennyiben a mozgó fázis összetétele az eljárás során állandó izokratikus áramlásról beszélünk. Ettél eltérően az ún. gradiens áramlás esetén az elválasztási folyamat során változik a mozgó fázis összetétele. Például egy 20 perces gradiens során a kiindulási 10% metanolt tartalmazó összetétel 90% metanolra változik. A gradiens lehet növekvő vagy csökkenő is. A gradiens elúció előnye, hogy felgyorsíthatjuk az elválasztást, mivel a gyorsabban eluálódó komponensek eltérő körülmények között eluálódnak az oszlopról, mint amelyeknek nagyobb a visszatartásuk a kolonnán. Az oldószer-összetétel megváltoztatásával az elválasztandó komponensek szelektíven jobban vagy kevésbé köthetők a mozgó fázishoz.

Kolonna paraméterek

Belső átmérő

Az érzékenységet és a vizsgálandó anyag kolonnára vihető mennyiségét befolyásoló kritikus paraméter a HPLC oszlop belső átmérője (Internal diameter - ID). Nagyobb kolonnákkal általában ipari alkalmazásoknál találkozunk, mint például gyógyszer alapanyagok tisztítása során. A szűk átmérőjű kolonnáknak nagyobb az érzékenységük és kisebb az oldószer fogyasztásuk aminek a kis terhelhetőség az ára.

• A nagyobb átmérőjű kolonnákat (10 mm felett) anyagok preparatív célú tisztítására használják nagy töltési kapacitásuk miatt.
• A legnépszerűbb kolonna típus az analitikai kolonna (4,6 mm), bár a kisebb kolonnák is egyre inkább teret nyernek. Különféle minták hagyományos mennyiségi elemzéséhez használják leggyakrabban UV/Vis abszorpciós detektorral.
• Narrow-bore (szűk keresztmetszetű) kolonnákat (1–2 mm) olyan esetekben használnak, ha nagy érzékenységre van szükség vagy speciális UV/Vis detektorral, fluoreszcens detektálással vagy más detektálási módszerrel, például HPLC-hez csatolt tömegspektrométerrel.
• Kapilláris kolonnákat (0,3 mm alatt) szinte csak alternatív detektálási technikákkal, például tömegspektrométerrel használnak. Általában ömlesztett szilika kapillárisból készülnek, eltérően a nagyobb belső átmérőjű kolonnáknál általánosan használt rozsdamentes acél burkolattól.

Részecske méret

A tradicionális HPLC technikában a kis gömb alakú szilícium-dioxid kötött állófázis a leggyakoribb. Ezek a szemcsék több méretben is készülnek, a leginkább használt méret az 5 μm. A kisebb szemcsék általában jobb elválasztást biztosítanak, de az optimális lineáris áramlási sebességhez szükséges nyomás fordítottan arányos a szemcseméret négyzetével. Ez azt jelenti, hogy felére csökkentve a szemcsék méretét a kolonna méretének megtartása mellett a teljesítményt kétszeresére növekszik, ám eközben a szükséges nyomás négyszeresére nő. Nagyobb szemcséket peparatív HPLC-nél (kolonna átmérő 5 cm és >30 cm között) és nem HPLC-s alkalmazásoknál, például szilárd fázisú extrakciónál használatosak. Az utóbbi tíz évben 3 μm és ennél kisebb szemcsék alkalmazására és erre megfelelő készülékek kifejlesztésére került sor. Ezen fejlemények a UHPLC tárgyát képezik.

Pórusméret

Sok álló fázis porózus, hogy nagyobb legyen a fajlagos felület. A kisebb pórusok nagyobb fajlagos felületet biztosítanak, míg a nagy pórusok kinetikai paraméterei jobbak, különösen nagyobb vizsgálandó anyagok esetén. Például egy fehérje molekula, amely nem sokkal kisebb, mint a pórus mérete behatolhat a pórusba, de ha egyszer bent van nem könnyen jön ki belőle.

Pumpanyomás

Az alkalmazott pumpák nyomáskapacitása eltérő lehet, teljesítményüket aszerint ítéljük meg, hogy mennyire képesek állandó és reprodukálható áramlási sebességet biztosítani. Az elérhető nyomás 400 bar. A modern HPLC készülékek ennél magasabb nyomáson is képesek dolgozni, így sokkal kisebb szemcseméretű kolonnák alkalmazására is lehetőség nyílik (<2 μm). Ezek az „Ultra High Performance Liquid Chromatography” rendszerek egészen 1200 bar nyomásig képesek dolgozni.

Fordítás

• Ez a szócikk részben vagy egészben a High performance liquid chromatography című angol Wikipédia-szócikk fordításán alapul. Az eredeti cikk szerkesztőit annak laptörténete sorolja fel. Ez a jelzés csupán a megfogalmazás eredetét és a szerzői jogokat jelzi, nem szolgál a cikkben szereplő információk forrásmegjelöléseként.